大分子互作验证

酵母单杂交系统将目标 DNA 序列（诱饵）克隆至报告基因上游，待检测的转录因子与 GAL4 激活域融合表达。若转录因子可直接结合该 DNA 序列，即可重构转录激活因子并启动报告基因表达，是验证转录因子-靶基因启动子互作的经典体内方法。

酵母双杂交将两种待研究蛋白分别与 GAL4 的 DNA 结合域（BD）和转录激活域（AD）融合。若蛋白 A 与蛋白 B 发生相互作用，BD 与 AD 在空间上靠近并重构完整转录因子，从而激活报告基因表达。该技术兼具验证已知互作与筛选 cDNA 文库两种功能。

DNA Pull Down 利用生物素标记的 DNA 探针作为“诱饵”，与细胞核蛋白提取液孵育后，通过链霉亲和素磁珠捕获 DNA-蛋白复合物，结合 LC-MS/MS 或 Western Blot 鉴定特异性结合的蛋白（如转录因子）。该技术探针设计灵活、蛋白保持天然构象、特异性强。

RNA Pull Down 以体外转录合成的生物素标记 RNA 为探针，与细胞或组织总蛋白孵育，形成 RNA-蛋白复合物后由链霉亲和素磁珠富集，经洗脱和 LC-MS/MS 检测，系统鉴定与目标 RNA 直接结合的蛋白。

GST / Halo Pull Down 将目标蛋白与 GST、Halo 或 His 等标签融合后体外表达，利用标签与亲和介质的特异性结合纯化诱饵蛋白，同时将与其直接作用的蛋白“下拉”。该技术不受抗体和物种限制，可明确两个蛋白是否直接结合，也可通过截短体分析定位互作结构域。

EMSA 基于生物素或同位素标记的核酸探针与蛋白特异性结合后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中迁移率降低的原理，形成滞后条带。通过设计验证性、竞争性或超迁移（Super-shift）实验，可精确判断 DNA 结合蛋白与靶序列的互作关系。

RNA-EMSA 将标记的 RNA 探针与待测蛋白共同孵育，若二者形成复合物，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中迁移速度会慢于游离探针，出现特征性阻滞条带。该技术常用于验证 RNA 结合蛋白及其在 RNA 上的结合区域。

免疫共沉淀（Co-IP）利用抗体与诱饵蛋白的特异性结合，在细胞非变性裂解液中捕获与诱饵蛋白结合的相互作用蛋白，通过 Western Blot 验证已知互作或通过 LC-MS/MS（Co-IP-MS）高通量鉴定未知互作蛋白。其优势在于蛋白结合在细胞内完成，更能反映天然状态下的相互作用。

Dual-LUC 将目标启动子或调控序列克隆至萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）报告基因上游，同时转染海肾荧光素酶（Renilla luciferase）作为内参，通过检测两者荧光信号比值，精确反映转录因子、非编码 RNA 或信号通路对靶基因的调控强度。

LCI 将荧光素酶蛋白拆分为 N 端（NLuc）和 C 端（CLuc）两个无活性片段，分别与待检测的两个目标蛋白融合表达。若两个蛋白发生相互作用，NLuc 与 CLuc 在空间上靠近并重构为具有催化活性的荧光素酶，在底物存在时产生可检测的荧光信号，适用于植物和动物活体体系。